Методы выявления нервной ткани. Введение

Гистологический препарат является основным объектом изучения.

Он должен быть тонким (5-10 мкм), прозрачным, легко пропускать пучок света и может представлять собой тонкий срез органа, тотальный препарат (напр., мягкая мозговая оболочка), отпечаток органа (напр., отпечаток печени или селезенки), мазок (напр., мазок крови или костного мозга), пленку из ткани (рыхлая соединительная ткань).

Классическим и основным объектом исследования в гистологии продолжает оставаться фиксированный и окрашенный срез ткани или органа.

Процесс изготовления гистологического препарата включает следующие основные этапы:

1) взятие материала и его фиксация;

2) уплотнение материала;

3) изготовление срезов;

4) окрашивание срезов;

5)заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды (полистирол, целлоидин).

Фиксация микропрепарата

Фиксация заключается в том, что взятый из органа маленький кусочек (3-5 мм) погружают в фиксатор (формалин, 70 0 спирт и др.). Фиксация предотвращает процессы разложения и тем самым способствует сохранению целостности структур, коагуляции белков и прекращению жизнедеятельности, а структуры становятся мертвыми, фиксированными.

Уплотнение микропрепарата

Для уплотнения кусочков применяют различные вещества, чаще всего парафин, целлоидин, органические смолы. Залитые в уплотняющие среды кусочки приобретают пластичность, необходимую для приготовления из них тонких срезов.

Изготовление срезов

Приготовление срезов толщиной от 5 до 50 мкм производят на специальных аппаратах – микротомах.

Окрашивание срезов

Окрашивание срезов применяют для увеличения контрастности отдельных гистологических структур при рассматривании их в микроскопах. Методы окрашивания гистологических срезов очень разнообразны. При обработке срезов красителями происходят сложные химические и физические процессы.

Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные.

Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными , а окрашивающиеся основными красителями – базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются гетерофильными или нейрофильными . Наиболее часто употребляемые красители – гематоксилин и эозин. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, эозин – кислый краситель, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Окрашенные препараты далее обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле.

Для длительного хранения гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может хранится много лет и быть использован для изучения под микроскопом.

Методы выявления элементов нервной и эластической тканей.

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет

Гистохимия.

Гистохимия , раздел гистологии, изучающий химические свойства тканей животных и растений.

Задача Г. - выяснение особенностей обмена веществ в тканевых клетках (см. Клетка) и межуточных средах. Она изучает изменения свойств клеток в процессе развития, связи между работой, метаболизмом и обновлением зрелых клеток и тканей. Основной принцип гистохимических методик - связывание определённого химического компонента клеток с красителем или образование окраски в процессе реакции. Ряд методов (цитофотометрия, люминесцентная и интерференционная микроскопия) исходит из физических свойств веществ. С помощью разных гистохимических методов можно определить локализацию и количество многих веществ в ткани, их метаболизм (тканевая авторадиография), связи с субмикроскопической структурой (электронная Г.), активность ферментов. Перспективным направлением является также иммуногистохимия. Наиболее точные гистохимические методы, позволяющие исследовать структуры клетки, называют цитохимическими (см. Цитохимия).

Первые специальные гистохимические исследования принадлежат французскому учёному Ф. Распайлю (1825-34). Интенсивно Г. стала развиваться с 40-х гг. 20 в., когда появились надёжные методы определения в клетке белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, некоторых неорганических компонентов. С помощью гистохимических методик удалось, например, впервые показать связь изменений количества РНК с синтезом белка и постоянство содержания ДНК в хромосомном наборе.

Источники развития нервной ткани

Морфофункциональная характеристика нейроцитов

Классификация нейронов

Классификация, морфофункциональная характеристика глиоцитов

Классификация, морфофункциональная характеристика нервных волокон

Понятие о рефлекторной дуге

Гематоэнцефалический барьер

Возрастные изменения, регенерация нервной ткани

Источники развития нервных тканей

Нервная ткань является основным тканевым элементом нервной системы, как соматической, так и вегетативной.

Функции:

Регулирует деятельность всех тканей и органов

Осуществляет взаимосвязь всех органов и систем в условиях целого организма (интегрирует)

Обеспечивает связь человека с окружающей средой (адаптирует)

Обеспечивает гомеостаз

Развитие:

Источником развития нервной ткани является нейроэктодерма. В результате нейруляции из дорсальной эктодермы образуется нервная трубка и ганглиозная пластинка. Эти зачатки состоят из малодифференцированных клеток первого дифферона - медулобластов , которые интенсивно делятся митозом. Медулобласты, в свою очередь, очень рано начинают дифференцироваться и дают начало еще 2 дифферонам: нейробластическому дифферону (нейробласты - молодые нейроциты - зрелые нейроциты (нейроны)); спонгиобластическому дифферону (спонгиобласты – глиобласты - макроглиоциты).

Нейробласты в цитоплазме имеют хорошо выраженную гранулярную ЭПС, пластинчатый комплекс, митохондрии и нейрофибриллы и характеризуются наличием одного отростка (аксона). Они способны к миграции, но утрачивают способность к делению.

Молодые нейроциты интенсивно растут, у них появляются дендриты, в цитоплазме образуется базофильное вещество, формируются первые синапсы.

Стадия зрелых нейроцитов - самая длительная стадия; в ходе нее нейроциты приобретают свои окончательные морфофункциональные особенности, у клеток увеличивается количество синапсов.

Нейроны и макроглиоциты – основные клетки нервной ткани.

Элементы второго дифферона – микроглиоциты образуются из клеток крови моноцитарного ряда (клетки Гортега). Функция их - защитная, они являются мозговыми макрофагами, имеют отростки и способны к свободному передвижению. При раздражении они меняют свою форму, становятся шарообразными, отростки увеличиваются, образуются выпячивания мембраны. Такие клетки способны распознавать и разрушать АГ попавшие в нервную ткань, а так же поврежденные и старые нейроны.

Морфофункциональная характеристика нейронов

Структурно-функциональной единицей нервной ткани является нейрон (синонимы: нейроцит, нервная клетка, неврон), окруженный глией.

Каждый нейрон состоит из:

Тело нейрона

Отростков

Окончаний

Размеры тел нейронов широко варьирует от 5 до 150 мкм.

Ядро нейроцита – обычно одно крупное, круглое, содержит сильно деконденсированный (эу-) хроматин; в нем находится несколько или 1 хорошо выраженное ядрышко. Множественные ядра встречаются у нейронов только вегетативной нервной системе (в ганглиях шейки матки и предстательной железы в нейронах могут содержать до 15 ядер).

В цитоплазме имеется хорошо выраженная гранулярная ЭПС, пластинчатый комплекс и митохондрии. Под световым микроскопом цитоплазма базофильна из-за наличия базофильного вещества (синоним: хроматофильная субстанция, тигроид, субстанция Ниссля). В конце 19 века Ф. Ниссль впервые описал в цитоплазме нейронов зерна, выявленные при окраске анилиновыми красителями (толуидиновым синим). Базофильное вещество встречается в перикарионе и дендритах, но отсутствует в аксонах, начиная от аксонального холмика Количество его меняется в зависимости от функционального состояния нейрона (при активной работе клетки – увеличивается). При электронной микроскопии выявлено, что базофильное вещество нейроцитов соответствует гранулярной ЭПС.

В цитоплазме нейроцитов содержится органоид специального назначения нейрофибриллы , состоящие из нейрофиламентов и нейротубул. Нейрофибриллы - это фибриллярные структуры диаметром 6-10 нм из спиралевидно закрученных белков; выявляются при импрегнации серебром в виде волокон, расположенных в теле нейрона беспорядочно, а в отростках - параллельными пучками. Функция их: опорно-механическая (формирование цитоскелета) и участие в транспорте веществ по нервному отростку.

В телах нейронов содержится 2 вида пигмента : меланин и липофусцин (пигмент изнашивания). В 70х гг. 20 века появилась новая теория, по которой липофусцин участвует в энергообмене клеток с высокой импульсной активностью при дефиците кислорода (гипоксии).

Отличительной особенность нейроцитов является обязательное наличие отростков , которые могут достигать до 1,5 метров в длину, их образование является характерной чертой всех зрелых нейронов. Среди отростков различают аксон - аxon (ось) у клетки всегда только 1, обычно длинный отросток; проводит импульс от тела нейроцита к другим клеткам (клеткам мышцы, железы или телам нейронов) и дендрит – dendron (дерево) - у клетки 1 или чаще несколько, обычно сильно разветвляется и проводит импульс к телу нейроцита .

Аксон и дендрит - это отростки клетки, покрытые цитолеммой, внутри содержат нейрофиламенты, нейротрубочки, митохондрии, везикулы. Обнаружено, что в отростках существует течение цитоплазмы от тела нейрона на периферию – антероградный ток . Выделяют медленный антероградный ток со скоростью 1-5 мм/сут. и быстрый транспорт белков, предшественников нейромедиаторов и др. (50-2000 мм/сут). Причем при транспорте веществ по отросткам большую роль играют нейротубулы, белки кинезин и динеин. Антероградный транспорт необходим для обеспечения роста аксонов при развитии и регенерации. В аксонах, кроме того, существует ретроградная быстрая транспортировка веществ (от периферии к телу нейроцита) со скоростью 50-70 мм/сут.. Так транспортируются, например, факторы роста нервов, а также некоторые вирусы.

Благодаря аксональному транспорту осуществляется постоянная связь между телом клетки и отростками.

Нервные отростки заканчиваются концевыми аппаратами – нервными окончаниями . Выделяют три вида нервных окончаний

Окончания, образующие нейрональные синапсы и осуществляющие связь нейронов между собой (бывают синапсы с химической передачей, с электрической передачей и смешанные).

Эффекторные нервные окончания (передающие нервный импульс на ткани рабочего органа либо выбрасывающие нейросекрет в кровь) – двигательные и секреторные.

Рецепторные нервные окончания (чувствительные, воспринимающие внешние или внутренние раздражители) - рецепторы.

Классификация нейронов

По форме нейроны бывают:

звездчатые, пирамидные, веретеновидные, паукообразные, округлые и др.

По функции нейроны делятся на:

афферентные (чувствительные, рецепторные) – генерируют нервный импульс под действием раздражителей и передают его в нервный центр;

ассоциативные (вставочные) - осуществляют связь между нейронами;

эффекторные или эфферентные (двигательные или секреторные) – передают нервный импульс на клетки рабочих органов или вырабатывают первичный нейросекрет в кровь.

По строению (количеству отростков) нейроны бывают:

униполярные - с одним отростком аксоном (у человека такую форму имеют нейробласты);

биполярные:

Истинные биполярные (аксон и дендрит отходят от тела нейроцита раздельно) – нейроны сетчатки глаза, спиралевидного ганглия внутреннего уха;

Псевдоуниполярные (от тела нейроцита аксон и дендрит отходят вместе как один отросток и на определенном расстоянии разделяются на два) – нейроны чувствительных спинальных узлов.

мультиполярные - с 3 и более отростками – большинство нейронов ЦНС.

По оказываемому эффекту:

возбуждающие

тормозные

смешанные.

По отношению к системам:

соматические

вегетативные

Классификация, морфофункциональная характеристика глиоцитов

В 1846 г. Немецкий патолог Р. Вирхов обнаружил в нервной ткани клетки, которым дал название глия (glia – клей). Он предположил, что эти клетки необходимы, чтобы склеивать нейроны.

Сегодня глиоциты рассматривают как вспомогательные клетки нервной ткани.

Функции (около 17):

1. Трофическая

   Разграничительная

   Секреторная

   Защитная

Выделяют следующие виды глии: макроглию (глиоциты) и микроглию.

Среди макроглиоцитов различают: эпендимоциты, астроциты, олигодендроциты.

1. Эпендимоциты: По строению напоминают эпителий, участвует в образовании и регуляции состава ликвора. Выделяют 3 типа клеток:

а. Эпендимоциты 1 типа - лежат на базальной мембране мягкой мозговой оболочки и участвуют в образовании гематоэнцефалического барьера, через который проходит ультрафильтрация крови с образованием спинномозговой жидкости субарахноидального пространства.

в. Эпендимоциты 2 типа - выстилают спинномозговой канал и все желудочки мозга. Они кубической формы, в цитоплазме хорошо развиты секреторные органеллы и митохондрии, содержится жировые и пигментные включения. На апикальной поверхности они имеют реснички, которые, двигаясь, создают однонаправленный ток спинномозговой жидкости. Реснички развиты у детей, у взрослых же они редуцируются и сохраняются лишь в Сильвиевом водопроводе. Эти клетки синтезируют в просвет желудочков мозга цереброспинальную жидкость.

с. Танициты– находятся на боковых поверхностях стенки III желудочка мозга и срединного возвышения ножки гипофиза, кубической или призматической формы, апикальная поверхность покрыта микроворсинками, а от базальной отходит длинный отросток, пронизывающий всю толщу головного мозга и заканчивающийся пластинчатым расширением на кровеносных капиллярах. Они транспортируют вещества из спинномозговой жидкости трансцеребрально в кровь.

2. Астроциты: Это мелкие, похожие на звезды клетки с многочисленными отростками, отходящими во все стороны.

Астроциты подразделяются на 2 типа:

а. Протоплазматические: их много в сером веществе ЦНС. Имеют большое ядро, развитую ЭПС, рибосомы и микротрубочки, а также значительное количество ветвящихся отростков. Выполняют трофическую и разграничительную функцию.

в. Волокнистые астроциты: их много в белом веществе ЦНС. Это небольшие клетки, которые имеют 20-40 гладкоструктурированных слабоветвящихся отростков, образующих глиальные волокна. Основная их функция – опорная, разграничительная, трофическая.

Все астроциты одними отростками контактируют с кровеносными капиллярами, образуя периваскулярные глиальные мембраны, а другими с нервными клетками или их отростками.

3. Олигодендроциты : их наибольшее количество. Они окружают тела нейронов как в периферической (мантийные клетки (сателлиты)), так и в центральной нервной системе (центральные глиоциты), а так же нервные волокна (нейролеммоциты или Шванновские клетки). Имеют овальную или угловатую форму и несколько коротких слаборазветвленных отростков. Они бывают светлые, темные и промежуточные. При электронной микроскопии выявлено, что плотность цитоплазмы приближается к плотности у нервных клеток, но они не содержат нейрофиламентов. Они осуществляют трофику нейронов и отростков, синтезируют компоненты оболочек нервных волокон, регулируют регенерацию нервных волокон.

Классификация, морфофункциональная характеристика нервных волокон

Нервное волокно - отросток нервной клетки, окруженный леммоцитами.

Классификация:

По отношению к системам:

соматические

вегетативные

По отношению к нервным узлам:

1. преганглионарные

   постганглионарные

По наличию миелина:

безмиелиновые (безмякотные)

миелиновые (мякотные)

По скорости проведения нервного импульса

волокна типа А (быстропроводящие)

волокна типа В

волокна типа С (медленнопроводящие)

Формирование волокон

При формировании безмиелинового нервного волокна осевой цилиндр (аксон) прогибает цитолемму леммоцита и продавливается до центра клетки; при этом осевой цилиндр отделен от цитоплазмы цитолеммой леммоцита и подвешен на дупликатуре этой мембраны (брыжейка или мезаксон). В продольном срезе безмиелинового волокна осевой цилиндр покрыт цепочкой леммоцитов, как бы нанизанных на этот осевой цилиндр. Как правило, в каждую цепочку леммоцитов погружаются одновременно с разных сторон несколько осевых цилиндров и образуется так называемое "безмиелиновое волокно кабельного типа". Безмиелиновые нервные волокна имеются в постганглионарных волокнах рефлекторной дуги вегетативной нервной системы. Нервный импульс по безмиелиновому нервному волокну проводится со скоростью 1-5 м/сек. 2. Начальный этап формирования миелинового волокна аналогичен безмиелиновому волокну. В дальнейшем в миелиновом нервном волокне мезаксон сильно удлиняется и наматывается на осевой цилиндр много крат раз, образуя много слоев. При электронной микроскопии каждый завиток мезаксона виден как чередование светлых и темных полос. Светлый слой шириной 8-12 нм, соответствует слоям липидов двух мембран, посередине и по-поверхности видны темные линии – это молекулы белков. Цитоплазма леммоцита также как и ядро оттесняется на периферию и образует поверхностный слой волокна. В продольном срезе миелиновое нервное волокно также представляет цепочку леммоцитов, "нанизанных" на осевой цилиндр. Границы между соседними леммоцитами в волокне называются перехватами Ранвье. Большинство нервных волокон в нервной системе по строению являются миелиновыми. Нервный импульс в миелиновом нервном волокне проводится со скоростью до 120 м/сек. Места, где слои мезаксона расходятся, называются насечками Шмидта-Лантермана. Последние можно увидеть только у волокон периферического нерва (из-за скорости роста отростков происходит натяжение мезаксона), в ЦНС у нервных волокон насечек нет.

Понятие о рефлекторной дуге

Нервная ткань функционирует по рефлекторному принципу, морфологическим субстратом которого является рефлекторная дуга.

Рефлекторная дуга – это цепь нейронов, связанных друг с другом синапсами, обеспечивающая проведение нервного импульса от рецептора чувствительного нейрона до эффекторного окончания в рабочем органе. Самая простая рефлекторная дуга состоит из двух нейронов чувствительного и двигательного. Более подробное описание будет представлено в разделе «Морфология спинного мозга».

Гематоэнцефалический барьер

В конце IX – начале XX веков впервые возникло понятие гистогематического барьера, но еще в 1885 году П. Эрлих придал особую значимость изучению обменных процессов между кровью и нервной тканью, выделив на первое место гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Он писал, что этот барьер имеет как научное значение, так и клиническое. Окончательно термин «ГЭБ» был утвержден в 1921 г. после работ Л. Штерн и Р. Готье по изучению проницаемости сосудов головного мозга для различных красителей, когда было продемонстрировано отсутствие красителя трипанового синего, введенного в общий кровоток, в веществе нервной ткани мозга, в то время как практически все другие ткани и органы были окрашены в синий цвет.

В настоящее время выделены 8 особых гистогематических барьеров, с различными уровнями организации барьерных функций, направленными на обеспечение общего и локального гомеостаза конкретного органа. К таким гистогематическим барьерам относятся: гематоэнцефалический, гематоофтальмический, гематотестикулярный, аэрогематический, гематотиреоидальный, гематотимический, плацентарный и гематоренальный. Гематоэнцефалический барьер представляет особую морфологическую систему, обеспечивающую гомеостаз нервной ткани. Функциональные механизмы барьера неоднозначны и включают как усиливающие, так и тормозящие процессы транспорта веществ из крови и мозга во встречных направлениях. Выделяют ГЭБ I и II типов.

Первым, и главным структурным элементом ГЭБ I типа является монослой эндотелия . Клетки эндотелия имеют толщину в безъядерной зоне от 200 до 500 нм, в области ядра до 2-3 мкм. Внутри эндотелиоцитов очень мало органелл и микропиноцитозных пузырьков. В клетках эндотелия капилляров этого типа отсутствуют фенестры.

Второй структурной единицей ГЭБ этого типа является базальная мембрана , которая имеет непрерывный характер и всегда хорошо выражена, ее толщина 40-80 нм.

Следующий составной компонент ГЭБ – это распластанный по поверхности базальной мембраны отросток клетки астроглии . Очень часто этот отросток называют «сосудистая ножка». В совокупности, контактирующие с помощью плотных контактов сосудистые ножки астроцитов, создают единую глиальную мембрану, в виде муфты покрывающую с поверхности капилляр. Представление о ГЭБ было – бы неполным, если не учесть контакта астроцитарного глиоцита с олигодендроглией – все вещества (98%) поступают к нейрону только через эти клетки (это 4 и 5 компоненты).

Капилляры 1 типа ГЭБ с непрерывным эндотелием в норме надежно защищают мозг от временных изменений состава крови.

Однако, вещества растворимые в липидах, а значит и в цитолемме эндотелия, могут проникать через ГЭБ I типа. К ним относятся в первую очередь: этиловый спирт, героин, никотин.

Кроме того, прекрасно транспортируется через ГЭБ глюкоза, более того, введение последней способствует снижению контакта, между клетками эндотелия и усилению проницаемости ГЭБ.

ГЭБ II типа имеется в нескольких областях ЦНС, и в первую очередь в гипоталамусе.

Морфологически в сосудах гипоталамуса эндотелий капилляров имеет фенестрированную цитоплазму, между эндотелиоцитами отсутствует плотный контакт, в стенке исчезают перициты, а базальная мембрана истончается в несколько раз по сравнению с барьером первого типа. Поэтому капилляры гипоталамуса высокопроницаемы для крупномолекулярных белковых соединений, даже для таких как нуклеопротеиды. Именно этим объясняется высокая чувствительность гипоталамуса к нейровирусным инфекциям и различным гуморальным веществам.

Возрастные изменения, регенерация нервных тканей

Возрастные изменения в нервной ткани связаны с утратой нейроцитами в постнатальном периоде способности к делению, и как следствие этого постпенным уменьшением количества нейронов, а также уменьшением уровня метаболических процессов в оставшихся нервных клетках.

Рассматривая процессы регенерации в нервных тканях, следует сказать, что нейроны являются наиболее высокоспециализированными клетками организма и, поэтому, утратили способность к митозу. Физиологическая регенерация (восполнение естественного износа) в нейронах хорошая и протекает по типу "внутриклеточной регенерации " – то есть клетка не делится, но интенсивно обновляет изношенные органоиды и другие внутриклеточные структуры. Хорошей «клеточной регенерацией» обладают только клетки глии.

Репаративной регенерацией сами нервные клетки не обладают, а их отростки, то есть нервные волокна способны регенерировать, при наличии определенных для этого условий. Дистальнее места повреждения осевой цилиндр нервного волокна подвергается деструкции и рассасывается. Свободный конец осевого цилиндра выше места повреждения утолщается - образуется "колба роста", и отросток начинает расти со скоростью 1 мм/день вдоль оставшихся в живых леммоцитов поврежденного нервного волокна, таким образом, эти леммоциты играют роль "проводника" для растущего осевого цилиндра (лента Бюнгнера). При благоприятных условиях растущий осевой цилиндр достигает бывшего рецепторного или эффекторного концевого аппарата и формирует новый концевой аппарат.

Контрольные вопросы

Окрашивание нервной ткани

При морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.

ФИКСАЦИЯ

При изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 - 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей - сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):

нейтральный формалин 15 мл

бромид аммония 20 г

дистиллированная вода 85 мл

Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю -Хортеге.

Продолжительность фиксации тонких (до 1,5 см) кусочков материала 2 - 15 дней.

Промывание в проточной воде.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):

пиридин 40 мл

96 % спирт 30 мл

Продолжительность фиксации 2 ч.

Промывание в проточной воде в течение 1 ч.

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 -б мм используют следующую схему:

50 % спирт 2 ч

70 % спирт 6 ч

80 % спирт 6 ч

96 % спирт 6 ч

100 % спирт I 6 ч

100% спирт II 6 ч

Продолжительность обезвоживания 32 ч

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.

Заливка в желатин по Снесареву

Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.

Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.

После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 - 2 ч до 1 - 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5- 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.

ОКРАШИВАНИЕ НЕЙРОНОВ

Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,- тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.

Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».

Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl - фиксация препаратов этиловым спиртом - выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.

Метод Ниссля

Фиксация.

Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.

Получение срезов.

Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 - 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.

Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10-15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.

Окрашивание срезов.

Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла, 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.

Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).

==========================================================

Окраска по Нисслю

==========================================================

Упрощенный метод Ниссля

Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.

Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.

Методика окраски

1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.

2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.

3. Дифференцируют в 96 % спирте.

4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.

5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.

6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.

7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.

==========================================================

ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 - 25 °С в коричневую склянку на стек­лянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 - 6 кусочков. Ку­сочки не должны быть слишком большими или слишком малень­кими (толщина 2 - 3 мм, площадь поверхности 5 - 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 - 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до пре­кращения образования осадка, затем помещают на 1 - 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитра­та серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 -2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 -4 ч, 4 % целлоидине 1 - 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1-4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 -10-дневные животные). Особенно благоприятными объекта­ми являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 - 5 дней, для глии 2 - 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 - 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 - 3 % раствора бихромата калия и 4 -5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 - 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80-100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 - 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

==========================================================

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 - 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

Метод Гольджи-Дейнеки

(для выявления синапсов)

1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.

2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2,5 мес.

3. Промывают в дистиллированной воде 3 - 4 мин.

4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0,5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.

7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут).

8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.

9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1,5 г тиосульфата натрия, 1,5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).

10. Промывают 10 - 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.

11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 - 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).

12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавеле­вой кислоты на 1 - 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).

13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 -3 мин.

14. Проводят через карбол-ксилол 1-2 мин, 2 - 3 порции ксилола и заключают.

Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты - более интенсивно.

==========================================================

Методы Бильшовского

Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность - 3 - 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные!) и применение чистых реактивов.

Импрегнация срезов

Материал фиксируют в растворе формалина (1:9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 -3 ч, затем в дистиллированной воде 1-2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной.5 - 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 - 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 - 4 раза.

Импрегнация:

1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;

2) быстро (2 - 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;

3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного се­ребра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия - образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0,875 - 0,910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 - 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 - 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;

4) быстро проводят через 2 - 3 порции дистиллированной воды;

5) восстанавливают в растворе формалина (1:4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, - срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;

6) промывают в воде 15 мин;

7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 - 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;

8) фиксируют 1-2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;

9) тщательно промывают в обычной воде (1-2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.

На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.

К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1:9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.

==========================================================

Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином

В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 - 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24- 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.

Тотальная импрегнация

Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 - 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0,5 - 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 -24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.

Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.

1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1:4 до 1:9), разрезают на кусочки толщиной не более 0,5 см и на 3 - 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.

2. Промывают 12 - 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.

3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 - 5 дней.

4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).

6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).

7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1:9) 10 - 12 ч.

8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.

При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.

Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.

М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.

Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 - 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.

С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.

==========================================================

Метод Адэра и Витгилию

(для выявления нейрофибрилл и синапсов)

Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 - 24 ч. Срезы толщиной 15-20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).

Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 - 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в 6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5-10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.

Результат: хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.

==========================================================

Методы Рамон-и-Кахаля

Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.

Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.

В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.

Метод I.

Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.

1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 - 5 дней в 0,75 - 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.

2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 - 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.

5. Заливают в целлоидин или парафин.

Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.

Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0,75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих-3 %, у беспозвоночных-6 % раствор. На 2-3 кусочка расходуют 80-100 мл раствора.

Метод II.

Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.

1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.

2. Разрезают на кусочки толщиной 2,5-3 мм, импрегнируют 5-7 дней в 1-1,5 % растворе нитрата серебра при 30-35 °С.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1-2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.

6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).

В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 - 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.

Метод III.

Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.

Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1-12 капель (для большого мозга 1-3 капли, моз­жечка-4, спинного и продолговатого мозга-8-12, периферических окончаний - 2 -3) раствора аммиака (молекулярная масса 0,910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2-4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод IV.

Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.

Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 - 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод V.

Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).

Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12-24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод VI.

Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.

Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 - 24 ч в проточной воде и 2 - 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод Рамона-Лермитта

(выявление дегенерированных синапсов)

Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 - 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 - 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга - 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга - 60 мин, мозжечка и таламуса - 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.

1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).

2. Промывают в дистиллированной воде.

3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.

4. Переносят в 0,5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.

5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде (2 - 3 смены)

7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.

8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.

==========================================================

Методика Бильшовского

(выявление внутриклеточных нейрофибрилл,

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ

Методика Снесарева

(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)

Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках - феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.

Материал фиксируют в 10 % формалине.

Срезы толщиной 8- 10 мкм получают на замораживающем микротоме.

1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 - 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).

2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.

3. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 -40 с.

4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).

5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая-Грюнвальда на 3 - 5 с.

6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 - 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.

7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 0,5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 - 3 ч в термостат при 37 - 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).

Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки - ядро и прилежащая цитоплазма,- становится розовой: от ярко­го цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.

Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая - Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8-10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.

==========================================================

Методика Рамон-и-Кахаля

(выявление волокнистой и астроцитарной глии)

Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 - 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).

2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.

Этапы окрашивания нервной ткани 1. Подготовка препарата Фиксация ü Обезвоживание ü Заливка ü Приготовление раствора ü 2. Окрашивание

Окрашивание нейронов. Метод Ниссля 1. 2. 3. 4. 5. 6. Фиксация Получение и окрашивание срезов Обезвоживавние Приготовление раствора Методика окрашивания Результат

Упрощенный метод Ниссля Фиксированный в спирте материал заливают в спирт целлоидин. Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время. Методика окраски 1. Расправленные срезы помещают в 0, 1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров. 2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте. 3. Дифференцируют в 96 % спирте. 4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом. 5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой. 6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают. 7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам. Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено

Окрашивание нервных волокон. Метод Шпильмейера Методика окраски 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды. 2. Переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, и подсушивают на воздухе. 3. Погружают в 2, 5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 сут (можно дольше) и держат в темном месте. 4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и обезжиривают в 96 % спирте 15 - 30 мин. 5. Помещают в гематоксилин (15 мл гематоксилина Бемера и 85 мл дистиллированной воды) на 1 сут и держат на свету. 6. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и дифференцируют в 2, 5 % растворе железоаммонийных квасцов (контролируя процесс под микроскопом). 7. Промывают в дистиллированной воде, затем оставляют на 30 мин в проточной воде. 8. Просушивают на воздухе, проводят через ксилол и заключают в бальзам. Результаты: на светлом слегка желтоватом фоне миелиновые волокна темно серо синеватого оттенка; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе того же оттенка.

Метод Хеквиста Методика окраски 1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду. 2. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды). 3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель. 4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам. Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно синий цвет.

Метод окрашивания синапсов Гольджи-Дейнеки 1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 %нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч. 2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2, 5 мес. . 3. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0, 5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут. 4. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь. 5. Переносят в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 - 3 сут). 6. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт. 7. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1, 5 г тиосульфата натрия, 1, 5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота). 8. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 - 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты). 9. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавелевой кислоты на 1 - 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия). 10. Проводят через карбол ксилол 1- 2 мин, 2 - 3 порции ксилола и заключают. Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты - более интенсивно.

Метод Глисса в модификации Владимировой 1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 - 4 дня. 2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч. 3. Срезы толщиной 12 - 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака. 4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым). 5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть. 6. Ополаскивают в проточной воде. 7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям). 8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути. 9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета. 10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия. 11. Промывают в дистиллированной воде. 12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам. Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания

Третий метод Рамон-и-Кохаль Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1- 12 капель (для большого мозга 1- 3 капли, моз жечка- 4, спинного и продолговатого мозга- 8- 12, периферических окончаний - 2 - 3) раствора аммиака (молекулярная масса 0, 910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2- 4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Окраска глии методом Рамон-и. Кохаля 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды). 2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. 4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания. 5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло. Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе - более светлые

Окраска глии методом Хорнеца 1. Срезы переносят в дистиллированную воду, на 100 мл которой добавлено 15 капель раствора аммиака (недолго). 2. Помещают в 5 % раствор бромисто водородной кислоты на 1 ч при температуре 37 °С. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды, а затем в дистиллированной воде, к которой добавлено несколько капель уксусной кислоты. 4. Переносят на 15- 24 ч в раствор, состоящий из 1 г трихлорида золота в 75 мл дистиллированной воды +25 мл 2 % сулемы+18 мл дистиллированной воды + 15 капель уксусной кислоты, препараты приобретают темно коричневую или красно коричневую окраску. 5. Помещают в 5 % раствор щавелевой кислоты (до приобретения ими серой окраски). 6. Ополаскивают в дистиллированной воде, переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия с несколькими каплями раствора аммиака; быстро ополаскивают и заключают. Результат: на сиреневом фоне выявляются темно синие фиброзные астроциты с отростками, видны капилляры и красные эритроциты в их просвете.